wtorek, 12 lipca 2011

Izolacja i oczyszczanie białek

Cel, w jakim ma być wykorzystane białko, determinuje dobór materiału biologicznego, z którego jest ono izolowane oraz metody jego oczyszczania. Zależą one od tego, czy otrzymywane białko powinno zachować swoją formę natywną i aktywność biologiczną (np. w badaniach enzymatycznych); czy powinno zostać oczyszczone do homogenności (np. w badaniach strukturalnych) lub czy ma być zastosowane jako lek. Najkorzystniejszym źródłem białka będzie materiał zawierający jak najwięcej izolowanego białka dającego się łatwo otrzymać w roztworze w formie stabilnej, a jednocześnie ubogi w zanieczyszczenia i możliwie najtańszy. Obecnie coraz częściej w celu uzyskania potrzebnych białek przeprowadza się ich produkcję w komórkach bakteryjnych, drożdżowych lub w hodowlach komórek ssaczych. Otrzymane w ten sposób białka nazywane są białkami rekombinowanymi. Zaletą takiego podejścia jest możliwość otrzymania dużej ilości potrzebnego białka, a jego oczyszczanie do homogenności jest stosunkowo proste. Dla każdego białka powinno się zastosować indywidualny schemat oczyszczania wykorzystujący jego własności fizykochemiczne i biologiczne.
Oczyszczanie białka można podzielić na kilka etapów:
1. wyodrębnianie z materiału biologicznego: rozdrobnienie materiału, rozbicie tkanek i komórek (homogenizacja, rozbicie ultradźwiękami), ekstrakcja białka do roztworu wodnego i usunięcie pozostałego materiału poprzez odwirowanie lub przesączenie,
2. wstępne oczyszczanie (opcjonalne): wytrącenie białka z roztworu w wyniku frakcjonowania wzrastającymi ilościami rozpuszczalników lub wysolenie siarczanem amonu i usunięcie czynnika wytrącającego białko przy pomocy dializy,
3. oczyszczanie: chromatografia (patrz niżej),
4. zmiana warunków jonowych (opcjonalne): dializa (patrz niżej),
5. analiza czystości preparatu: elektroforeza (patrz niżej).
Najczęściej izolację białek przeprowadza się w niskiej temperaturze (2 - 4oC) i w obecności inhibitorów proteaz (enzymów degradujących białka).
Chromatografia jest to szeroki zakres metod używanych do rozdzielania i/lub analizowania złożonych mieszanin związków różniących się właściwościami fizykochemicznymi (ładunkiem, wielkością, kształtem, rozpuszczalnością), a także właściwościami biologicznymi. Metodami chromatograficznymi można rozdzielać aminokwasy, peptydy, białka, nukleotydy, kwasy nukleinowe, lipidy i cukry. Cząsteczki podlegające rozdziałowi chromatograficznemu rozmieszczają się pomiędzy dwie fazy: fazę stacjonarną i fazę ruchomą, która przepływa przez fazę stacjonarną. W zależności od rodzaju fazy stacjonarnej rozróżniamy chromatografię bibułową, cienkowarstwową, gazową i cieczową. Białka rozdzielamy metodą chromatografii cieczowej, gdzie fazę stacjonarną stanowi złoże hydrofilowe, które mogą stanowić nierozpuszczalne związki agarozy, dekstranu lub polimerów akryloamidu. Przy oczyszczaniu białek najczęściej wykorzystujemy chromatografię kolumnową. Kolumna to rurka szklana, plastikowa lub metalowa wypełniona złożem (faza stacjonarna) zrównoważonym buforem o odpowiednim składzie jonowym i pH. Mieszaninę rozdzielanych białek wprowadzamy na kolumnę w buforze fazy ruchomej. Im większe powinowactwo białka do fazy stacjonarnej tym wolniej przesuwa się na kolumnie. Białka są eluowane (wymywane) z kolumny kolejnymi porcjami buforu w zależności od ich powinowactwa do złoża – najsłabiej zaadsorbowane pojawią się w eluacie jako pierwsze, najsilniej – jako ostatnie. Różne typy chromatografii cieczowej wykorzystują różne własności białek (tab. 2).
                                            Tab. 2. Wybrane typy chromatografii białek
Aby otrzymać wysoce oczyszczone białko na ogół trzeba zastosować procedurę składającą się z kilku rozdziałów chromatograficznych. Techniki chromatograficzne różnią się złożami fazy stacjonarnej. W ramach tego ćwiczenia wykonana zostanie chromatografia kolumnowa na przykładzie filtracji żelowej. Do filtracji żelowej wykorzystuje się obojętne chemicznie, hydrofilowe, usieciowane złoże, uformowane w ziarna z porami o ścisle określonych wymiarach. Cząsteczki większe niż pory nie mogą do nich wniknąć i przemieszczają się w kolumnie szybciej niż małe cząsteczki, które zajmują przestrzeń wewnątrz i na zewnątrz ziaren. Zatem, w wycieku z kolumny jako pierwsze pojawią się większe cząsteczki (rys. 2).
                                            Rys. 2. Chromatografia kolumnowa białek na przykładzie filtracji żelowej.
W zależności od stopnia usieciowania złoża można rozdzielać białka o różnej wielkości. Filtrację żelową można stosować także do usuwania substancji drobnocząsteczkowych z preparatów izolowanego białka oraz do wyznaczania masy nienaruszonych kompleksów wielobiałkowych. Inną metodą pozwalającą na usunięcie z wodnego roztworu związków drobnocząsteczkowych (takich jak np. sole, rozpuszczalniki organiczne, aminokwasy, nukleotydy oraz cukry proste) jest dializa. Polega ona na przechodzeniu przez półprzepuszczalną błonę (np. celulozową błonę woreczka dializacyjnego) cząsteczek mniejszych niż pory w tej błonie, do roztworu na zewnątrz woreczka, a zatrzymywaniu w roztworze w woreczku cząsteczek zbyt dużych, aby mogły przejść przez te pory (substancji wielkocząsteczkowych, np. białek lub kwasów nukleinowych). Przechodzenie przez błonę trwa do momentu wyrównania stężenia danego związku drobnocząsteczkowego po obu stronach błony i można je “napędzać” poprzez stałe mieszanie i wymianę roztworu na zewnątrz woreczka. Podczas kolejnych etapów oczyszczania oznacza się stężenie białka i ewentualnie jego aktywność enzymatyczną, co pozwala na stworzenie tzw. bilansu prepratyki. Stężenie białka można określić bezpośrednio mierząc absorpcję w świetle UV przy długości fali 280 nm (absorpcja aminokwasów aromatycznych) lub przeprowadzając w sposób ilościowy białka w barwne kompleksy i mierząc ich absorpcję w świetle widzialnym. Czystość otrzymanych preparatów białkowych kontrolujemy elektroforetycznie (metoda analityczna).
Elektroforeza oznacza przemieszczanie się cząstek obdarzonych ładunkiem (jonów) w polu elektrycznym, np. cząsteczek białek lub kwasów nukleinowych. Większość metod elektroforetycznych wykorzystuje specyficzne nośniki – żele poliakryloamidowe lub agarozowe, bibułę. Przemieszczanie się jonów w polu elektrycznym zależy od ich ładunku, wielkości i kształtu. Im większy jon lub bardziej rozbudowany jego kształt tym wolniej porusza się w polu elektrycznym, a im bardziej naładowany – tym porusza się szybciej. Jony naładowane ujemnie migrują do anody, naładowane dodatnio do katody. W przypadku cząstek zawierających w swym składzie ugrupowania naładowane dodatnio i ujemnie (np. białka), o kierunku migracji decyduje ich ładunek wypadkowy. Białka najczęściej rozdzielamy metodą elektroforezy w żelach poliakryloamidowych w obecności SDS (SDSPAGE, polyacrylamide gel electrophoresis), przy której ich rozdział jest zależny tylko od ich wielkości. SDS (dodecylosiarczan sodu) jest detergentem anionowym denaturującym i opłaszczającym białko, w wyniku czego łańcuch polipeptydowy: (a) traci struktury wyższego rzędu i (b) staje się anionem. Dodatkowo, przeprowadza się redukcję wiązań dwusiarczkowych białka i w wyniku tego jego poszczególne łańcuchy polipeptydowe funkcjonują w roztworze niezależnie od siebie. W efekcie, wszystkie białka (łańcuchy polipeptydowe) mają taki sam, liniowy kształt oraz ładunek ujemny, a szybkość ich migracji w żelu zależy wyłącznie od ich wielkości. Białka na ogół są bezbarwne. W związku z tym po przeprowadzonym rozdziale żel trzeba zabarwić, aby uwidocznić obecne w nim białka. W tym celu najczęściej stosuje się barwienie błękitem kumasyny lub związkami srebra. SDS-PAGE wykorzystuje się także do wyznaczania masy cząsteczkowej analizowanego białka (przez porównanie z wielkością białek wzorcowych) oraz do określania liczby jego podjednostek polipeptydowych.


Jeśli ten artykuł Cię zainteresował lub w jakikolwiek sposób pomógł w zrozumieniu biochemii spróbuj teraz pomóc mi. Kliknij w jakąkolwiek reklamę na moim blogu. Dziękuję bardzo!!
Pozdrawiam,
SzPak.

1 komentarz:

  1. Bardzo przydatny materiał, dziękuję za pomoc w zdobyciu wiedzy na zbliżające się egzaminy :)

    OdpowiedzUsuń